중합 효소 연쇄 반응 PCR 제품의 클로닝

최적의 삽입 조각: 캐리어 비율은 실험을 통해 결정해야 합니다. 1: 1 (삽입: 벡터) 은 종종 최적의 비율이며 1: 8 또는 8: 1 의 몰비도 허용됩니다. 비율 범위를 결정해야 합니다. 연결의 경우 5ul 2X 연결 효소, 50ng 플라스미드 DNA, 1Weiss 단위의 T4 연결 효소 및 삽입 조각 *** 10ul 입니다. 온도를 실온 65438 0 시간 동안 유지하거나 4 C 에서 밤을 지냅니다. 이 두 온도에서 T- projection 이 부족한 전달체는 스스로 연결되어 파란 점을 만들어 낸다. 실온에서 온도 1 시간을 유지하면 대부분의 복제 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 연결효율을 높이기 위해서는 4 C 에서 밤을 보내야 한다.

2)2)PCR 제품은 겔 정제가 필요합니까?

예를 들어, 겔 분석에는 단 하나의 띠만 있으며 겔 정제는 필요하지 않습니다. 만약 다른 띠도 볼 수 있다면, 이량 부피에 많은 프라이머가 지친 것 같다. 소량의 프라이머 이량 체도 높은 몰 수를 가지고 있어 대상 삽입 조각 대신 프라이머 이량 체가 있는 높은 비율의 클론을 생성합니다. 그래서 복제하기 전에 젤순화가 필요하다.

3) 목표조각을 회수하지 않았다면 어떤 대조실험을 해야 합니까?

A) 패킷이 전환되지 않은 감각 세포.

균락이 있다면 암피실린 효과가 없거나 암피실린 내성이 있는 플라스미드가 오염되거나 암피실린 내성이 생기는 균락이다.

B) 전체 플라스미드를 변환하고, 식민지 성장 수를 계산하고, 변환 효율을 결정합니다.

예를 들어 희석 1ug/ul 플라스미드 1: 100, 1ul 변환1000 SOC 로 1000ul 로 희석한 후 판자에 100ul 을 깔았다. 밤새 배양한 후 1000 개의 식민지가 생겨났다. 전환율은 다음과 같습니다: 생성 된 식민지의 총 DNA 확산 수입니다.

판자 DNA 의 총량은 전환반응에 사용된 양을 희석 배수로 나눈 것이다. 특히 10ng DNA 로 변환하고 SOC 로 1000u 로 희석한 후 10 ng DNA 를 포함하고1을 사용합니다. 변환율은 다음과 같습니다.

1000 복제 x103ng/plank1ng DNA ug =106 cfu/ug.

108cfu/ ug 유도 세포로 PGEM-T 를 전환시킵니다.

집락이 없거나 집락이 적다면 감각 세포의 전환률이 너무 낮다는 것을 알 수 있다.

C) pGEM-T 양성 대조군 또는 PCR 산물로 생성 >: 20-40 개의 파란 점 (지정된 step 108cfu/ug 감각 세포 사용) 을 통해 전달체가 T 를 잃어버렸다는 것을 알 수 있습니다. 아마도 그 연결 효소가 핵산효소를 오염시켰을 것입니다. T4DNA 코넥아제 (M 180 1, M 1804, M 1794) 품질 기준 양호, 핵 없음

D) pGEM-T 또는 pGEM-T Easy vector 를 사용하여 고주파 감지 세포 (108cfu/ug) 를 변환하여 정해진 실험 단계에 따라 100 개의 식민지를 얻을 수 있습니다

4) 비교 실험의 결과는 좋지만 목표 단편으로 회수되지 않았다. 실험에 무슨 문제가 있습니까?

A) 연결은 실온에서 65438 0 시간 동안 유지되어 대부분의 복제를 만족시킬 수 있다. 효율성을 높이기 위해서는 4 C 에서 밤을 보내야 한다.

B) 삽입된 조각이 오염되어 3'-T 가 누락되었거나 연결 및 변환 억제가 발생합니다. 따라서 삽입된 조각을 pGEM-T 양성과 혼합하여 연결합니다. 대조되는 군락의 수가 줄어들면 삽입된 조각을 순화하거나 다시 준비해야 한다. 대량의 파란 점이 생성되면 삽입된 조각이 핵산효소에 오염되어 pGEM-T 또는 pGEM-T 가 쉽게 운반되는 3'-T 가 없어진다는 뜻입니다.

C) 조각 삽입은 연결에 적합하지 않습니다. 과도한 자외선으로 인해 젤로 정제된 삽입물이 생기기도 한다. 자외선을 너무 많이 비추면 플루토늄 이합체가 생겨 연결에 불리하며 DNA 는 다시 순수화해야 한다. (알버트 아인슈타인, 자외선, 자외선, 자외선, 자외선, 자외선, 자외선, 자외선)

D) 수리 기능을 갖춘 내열성 DNA 중합 효소의 증폭산물 끝에는 A 가 없다. 이는 pGEM-T 또는 pGEM-T Easy 캐리어를 복제하는 데 필요한 것이다. Taq DNA 중합 효소와 뉴클레오티드를 첨가하면 끝에 하나를 추가할 수 있다. 자세한 내용은 pGEM-T pGEM-T Easy carrier (TM042) 의 기술 데이터를 참조하십시오.

E) 고도로 반복되는 시퀀스가 불안정하여 증폭 과정에서 누락 및 재정렬이 발생할 수 있습니다. 삽입된 조각이 자주 삭제되고 리플로우되는 것을 발견하면 SURE 세포와 같은 재조합 결함형 대장균 균주를 사용해야 한다.

PCR 반응 시스템 및 반응 조건

표준 PCR 반응 시스템:

10× 증폭 버퍼 10ul

네 가지 dNTP 혼합물 각각은 200 μm ol/L 입니다.

각 인용구는 10 ~ 100 pmol 입니다.

템플릿 DNA 0. 1 ~ 2ug

Taq DNA 중합 효소 2.5u

Mg2+ 1.5 밀리모어/리터

100 마이크로리터에 증류수 2 인분 또는 3 인분을 넣으세요.

PCR 반응의 다섯 가지 요소: PCR 반응에 참여하는 물질은 주로 프라이머, 효소, dNTP, 템플릿, Mg2+ 의 다섯 가지입니다.

프라이머: 프라이머는 PCR 특이성 반응의 핵심이며, PCR 제품의 특이성은 프라이머와 템플릿 DNA 의 보완 정도에 따라 달라집니다. 이론적으로, 어떤 템플릿 DNA 의 서열도 알려져 있다면, 상호 보완적인 올리고 뉴클레오티드 사슬을 유인물로 설계하고 PCR 을 통해 체외에서 템플릿 DNA 를 증폭시킬 수 있다. ① 프라이머 길이: 15-30bp, 보통 20bp 정도입니다.

② 프라이머 증폭 스팬: 200-500bp 가 적당하며 특정 조건 하에서 10kb 조각으로 증폭될 수 있다.

③ 프라이머 라이브러리: 프라이머 디자인의 기본 원칙을 참조하십시오.

(4) 프라이머의 2 차 구조를 피하고, 두 프라이머 사이의 상보성, 특히 3' 끝의 상보성을 피한다. 그렇지 않으면 프라이머 이합체가 형성되어 비특이적 증폭대가 생긴다.

⑤ 프라이머 3' 끝의 염기, 특히 마지막과 끝에서 두 번째 염기는 정확히 일치해야 하며, 말단 염기의 잘못된 배합으로 인한 PCR 실패를 방지해야 한다.

⑥ 프라이머에 존재하거나 적절한 효소 절단 부위가 존재할 수 있으며, 증폭의 목적 서열은 적절한 효소 절단 부위를 갖는 것이 가장 좋다. 이는 효소 절단 분석이나 분자 복제에 매우 유리하다.

⑦ 유인물 특이성: 유인물은 핵산 서열 데이터베이스의 다른 서열과 뚜렷한 동원성이 없어야 한다. 유인량: 각 유인물의 농도는 0. 1 ~ 1 umol 또는 10 ~ 100 pmol 로 가장 낮은 유인량이 더 많다 높은 프라이머 농도는 잘못된 배합과 비특이적 증폭을 일으켜 프라이머 사이에 이합체를 형성할 수 있는 기회를 증가시킨다. 현재 사용할 수 있는 Taq DNA 중합 효소는 두 가지가 있는데, 하나는 수열포자균에서 정제된 천연 효소이고, 다른 하나는 대장균이 합성한 유전공학 효소이다. 전형적인 PCR 반응을 촉매하려면 약 2.5U 의 효소가 필요하다 (총 반응 볼륨이 100ul 인 경우). 농도가 너무 높으면 비특이적 증폭이 발생하고 농도가 너무 낮으면 합성물의 양이 줄어든다.

DNTP 품질 및 농도

DNTP 의 품질과 농도는 PCR 증폭의 효율성과 밀접한 관련이 있다. DNTP 분말은 알갱이로 잘 보존되지 않으면 생물학적 활성을 잃게 된다. DNTP 용액은 산성이며 고농도 후 1M NaOH 또는 1M Tris 로 준비해야 합니다. HCL 버퍼액의 PH 값을 7.0 ~ 7.5 로 조절하고 소량으로 나누어-20 C 에 냉동합니다. 냉동 융합을 반복하면 dNTP 가 분해된다. PCR 반응에서 dNTP 는 50 ~ 200 μm ol/L, 특히 네 가지 dNTP 의 농도가 같아야 합니다 (무어 배합 등). 이들 중 하나가 다른 것과 다르면 (더 높거나 낮은 경우) 불일치가 발생할 수 있습니다. 농도가 너무 낮으면 PCR 생산물의 생산량이 감소할 수 있다. DNTP 는 Mg2+ 와 결합하여 Mg2+ 의 농도를 낮출 수 있습니다.

템플릿 (표적 유전자) 핵산 템플릿 핵산의 수와 순수화 정도는 PCR 성패의 관건 중 하나이다. 전통적인 DNA 순화 방법은 보통 SDS 와 프로테아제 K 를 사용하여 샘플을 소화하고 처리한다. SDS 의 주요 역할은 세포막의 지질과 단백질을 용해시켜 막 단백질을 용해시켜 세포막을 파괴하고 세포 안의 핵단백질을 자유롭게 하는 것이다. SDS 는 또한 단백질과 결합하여 침전할 수 있습니다. 프로테아제 K 는 단백질, 특히 DNA 와 결합된 단백질을 가수 분해하고 소화한 다음 유기 용제 페놀과 클로로포름으로 단백질과 기타 세포 성분을 추출하고 에탄올이나 이소프로판올로 핵산을 침전시킬 수 있다. 추출한 핵산은 PCR 반응의 템플릿으로 사용될 수 있다. 일반적인 임상 샘플에서는 세포를 빠르고 쉽게 녹여 병원체 분해, 염색체의 단백질 소화, 목적 유전자를 헤엄쳐 PCR 증폭에 직접 사용할 수 있다. RNA 템플릿 추출은 일반적으로 이황산 브롬이나 프로테아제 K 법을 사용하여 RNA 효소가 RNA 를 분해하는 것을 방지한다. Mg2+ 농도는 PCR 증폭의 특이성과 생산량에 큰 영향을 미친다. 일반 PCR 반응에서 다양한 dNTP 의 농도가 200 μm ol/L 인 경우 Mg2+ 의 적절한 농도는 1.5 ~ 2.0 mmol/L..Mg2+ 농도가 너무 높으면 반응의 특이성이 떨어지고 농도가 너무 낮으면 Taq DNA 중합 효소의 활성성이 떨어지고 반응산물도 줄어든다. PCR 의 반응 조건은 온도, 시간 및 주기 수입니다.

온도 및 시간 설정: PCR 원리에 따라 트랜스젠더-어닐링-세 개의 온도 점 확장을 설정합니다. 표준 반응에서는 3 온점법을 사용한다. 이중 가닥 DNA 는 90 ~ 95 C 에서 변성한 후 40 ~ 60 C 로 빠르게 냉각한다. 프라이머는 어닐링한 후 과녁 시퀀스와 결합한 후 빠르게 70 ~ 75 C 로 가열한다. Taq DNA 중합 효소의 작용으로 프라이머 체인은 템플릿을 따라 확장됩니다. 짧은 표적 유전자 (길이가 100 ~ 300 BP 인 경우) 의 경우, 트랜스젠더 온도 외에 퇴화와 확장 온도를 결합할 수 있는 이중 온도 방법을 사용할 수 있습니다. 일반적으로 94 C 변성, 65 C 좌우 어닐링 확장 (이 온도에서 Taq DNA 효소는 여전히 높은 촉매 활성을 가지고 있음).

① 변성 온도와 시간: 변성 온도가 낮고 용융이 완전히 PCR 실패의 주요 원인은 아니다. 일반적으로 93 C ~ 94 C 의 시간은 템플릿 DNA 를 변성시키기에 충분하다. 93 C 미만이면 시간을 연장해야 하지만 온도가 너무 높아서는 안 된다. 고온환경이 효소의 활성화에 영향을 미치기 때문이다. 대상 유전자 템플릿이나 PCR 제품이 이 단계에서 완전히 변성되지 않으면 PCR 이 실패합니다.

② 어닐링 (리 폴딩) 온도와 시간: 어닐링 온도는 PCR 특이성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 트랜스젠더 후 신속하게 40 C ~ 60 C 로 식히면 프라이머와 레시피를 결합할 수 있다. 템플릿 DNA 는 프라이머보다 훨씬 복잡하기 때문에 프라이머와 템플릿 간의 충돌 결합 확률은 템플릿 보완 체인보다 훨씬 높습니다. 어닐링 온도와 시간은 프라이머의 길이, 염기 구성과 농도, 과녁 시퀀스의 길이에 따라 달라집니다. 20 개의 뉴클레오티드와 50% G+C 함량 프라이머의 경우 55 C 는 최적의 어닐링 온도를 선택하기 위한 이상적인 시작점입니다. 프라이머의 리 폴딩 온도는 다음 공식을 통해 적절한 온도를 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Tm 값 (용융 온도) =4(G+C)+2(A+T)

리 폴딩 온도 =Tm 값 -(5 ~ 10℃)

Tm 값의 허용 범위 내에서 높은 리 폴딩 온도를 선택하면 프라이머와 템플릿의 비특이적 결합을 크게 줄이고 PCR 반응의 특이성을 높일 수 있습니다. 리 폴딩 시간은 일반적으로 30-60 초이며 프라이머와 템플릿을 완전히 결합하기에 충분합니다.

③ 연장 온도와 시간: Taq DNA 중합 효소의 생물학적 활성;

70 ~ 80℃ 150 개의 뉴클레오티드/초/효소 분자

70 ℃에서 60 개의 뉴클레오티드/초/효소 분자

55 ℃에서 24 개의 뉴클레오티드/초/효소 분자

온도가 90 C 를 초과하면 DNA 합성은 거의 불가능합니다.

PCR 반응의 확장 온도는 일반적으로 70 ~ 75 C 이며, 일반적인 온도는 72 C 입니다. 과도한 확장 온도는 프라이머와 템플릿의 결합에 도움이되지 않습니다. PCR 확장 반응의 시간은 증폭될 세그먼트의 길이에 따라 달라집니다. 일반적으로 1Kb 이내의 DNA 세그먼트의 경우 1min 의 확장 시간으로 충분합니다. 3 ~ 4 KB 목표 순서는 3 ~ 4 분 정도 걸립니다. 10Kb 의 증폭은 15min 까지 확장해야 합니다. 연장이 너무 길면 비특이적 증폭대가 생길 수 있다. 저농도 템플릿의 증폭에 대해서는 연장 시간이 약간 길다. 필요에 따라 1 시약 저장 및 준비 영역, 2 샘플 준비 영역, 3 증폭 반응 혼합물 준비 및 증폭 영역, 4 증폭 생성물 분석 영역 등 4 개의 PCR 실험실이 있습니다. 레이아웃은 그림 1 을 참조하십시오. 그림 1 4 개의 PCR 랩 로케일

완전 자동 분석기를 사용하는 경우 영역을 적절히 병합할 수 있습니다. 증폭 영역과 생성물 분석 영역을 세 개의 증폭 검출 영역인 * * * 로 결합하는 것이 좋습니다. 레이아웃은 그림 2 에 나와 있습니다.

그림 2 3 개의 PCR 랩 로케일

보건부의 요구에 따라 각 작업 공간에 들어가는 것은 반드시 엄격하게 단일 방향을 따라야 한다. 즉, 시약 저장과 제비 구역에서만 들어갈 수 있을까? 표본 준비 영역 증폭 반응 혼합물 준비 및 증폭 영역? 교차 오염을 피하기 위해 제품 분석 영역을 확장하십시오. 각 작업 영역에는 공기 흐름 방향이 단일하도록 적절한 환기 장치가 설치되어 있어야 합니다. 작업 영역의 벽, 바닥, 사무용품은 반드시 소독약에 내성이 있는 재료로 만들어야 한다. 작업 영역에는 서로 다른 작업 영역의 장비와 물건이 혼동되지 않도록 명확한 표시가 있어야 합니다. 각 작업구역에는 배기팬, 에어컨, 부식방지 바닥과 조리대, 로커, 신발장, 전용 사무용품, 전용 작업복, 작업신발, 모바일 자외선등 등이 있어야 합니다. 안전과 건강의 필요성을 보장하기 위해서.

보건부 임상 유전자 증폭 실험실의 기본 설정 기준에 따르면 각 작업 공간에 필요한 기기 설비는 다음과 같다.

시약 저장 및 준비 영역

1.2-8 C 및-15 C 냉장고

2. 교반기

3. 미량 샘플러 (커버 1- 1000 마이크로리터)

4. 자외선 램프 이동 (작업대 근처)

소모품: 일회용 장갑, 일회용 흡수지, 내고압 원심관, 샘플러 흡두 (필터 포함).

특수 작업복 및 작업 신발

7. 특수 사무용품

두 개의 표본 준비 구역

1.2-8 C 냉장고,-20 C 또는-80 C 냉장고

고속 데스크탑 냉동 원심 분리기

3. 교반기

4. 수조 상자 또는 난방 모듈

5. 미량 샘플러 (커버 1- 1000 마이크로리터)

6. 이동식 자외선 램프 (작업대 근처)

7. 정화대

8. 소모품: "시약 저장 및 준비 구역" 의 소모품과 동일

9. 특수 작업복 및 작업화

10. 특수 사무용품

고분자 DNA 를 처리해야 한다면 초음파 수조기가 있어야 한다.

3 개의 유전자 증폭 영역 및 제품 분석 영역

1. 완전 자동 정량 핵산 증폭기 (컴퓨터 및 프린터 포함)

2. 미량 샘플러 (커버 1- 1000 마이크로리터)

이동식 자외선 램프 (작업대 근처)

4. 소모품: "시약 저장 및 준비 구역" 의 소모품과 동일

5. 특수 작업복 및 작업화

6. 특수 사무용품

각 대지에는 서로 다른 대지의 장비와 물건이 혼동되지 않도록 명확한 표시가 있어야 합니다. 작업 영역마다 다른 색상이나 뚜렷한 차이가 있는 작업복을 사용하여 식별해야 합니다. 노동자들이 작업장을 떠날 때, 그들은 각 구역의 특정 작업복을 꺼내는 것을 허락하지 않는다.

실험실 품질 관리

PCR 실험실 직원은 보건부나 성급 임상검사센터에서 조직한 임상 유전자 증폭 학원에 참가해 관련 증명서를 소지해야 한다. PCR 실험실은 검수를 통과했으며, 최소한 두 개의 실험실은' 임상 유전자 검사 합격증' 을 소지해야 한다. PCR 랩은 엄격한 실험실 관리 제도, 표준 운영 절차 (SOP) 등 일련의 품질 관리 문서를 구축해야 합니다. 이를 통해 실험실의 일상적인 운영이 보건부의 요구 사항을 충족하고, 테스트 결과의 정확성을 보장하며, 실험실의 위생 안전을 보장하고, 실험실의 장기적이고 안정적인 운영을 보장해야 합니다. 1. 접점 PCR: 처음 몇 주기 동안 온도가 점차 낮아집니다.

2. 역전사 PCR(RT-PCR): mRNA 역전사 DNA 를 템플릿으로 하여 얻은 DNA 에는 인트론 (유전자의 무의미한 단락) 이 포함되지 않습니다. 이는 분자 복제 기술에서 흔히 사용되는 방법입니다.

3. 열시동 PCR: 고열에 활성화되는 핵산 중합효소에 반응하여 비특이적 산물을 줄인다.

4. 실시간 PCR: PCR 중 형광 프로브 또는 염료를 사용하여 정량 검사를 수행합니다. 정량 PCR 이라고도 합니다.

5. 중첩 PCR: 먼저 저특이성 프라이머로 몇 개의 순환을 증폭시켜 템플릿 수를 늘린 다음 고특이성 프라이머로 증폭한다.

6. 다중 PCR: 동일한 시험관에서 여러 세트의 프라이머를 사용합니다.

7. PCR 재조정: PCR 산물을 희석 10 배로 희석한 후 원래 농도의 프라이머와 dNTP 에 세 번 넣어 생성물의 이합체를 제거한다.

8.dsRNA 복제자: 하이파이 DNA 중합 효소, T7RNA 중합 효소, PHi6RNA 복제자를 함께 사용합니다. 이중 가닥 DNA 에서 해당 이중 가닥 RNA(dsRNA) 로 전사합니다. RNAi 의 실험 작업에 적용할 수 있습니다.

9. 콜드 PCR (Co-Amplification Atlas Transformation Temperature-PCR): 돌연변이 또는 특수 대립 유전자를 감지하는 PCR 응용 기술입니다.