동물세포를 대규모로 배양하는 방법에는 어떤 것이 있나요?

동물세포의 대규모 배양을 위한 일반적인 방법

동물세포의 종류에 따라 부착배양, 현탁배양, 고정배양 등 3가지 배양방법을 사용할 수 있다. 대규모 문화.

1. 동물세포의 성장특성 및 배양온도

1. 세포는 성장이 느리고 쉽게 오염되며, 배양에는 항생제가 필요하다

2. 크고 세포벽이 없으며 기계적 강도가 낮고 환경 적응성이 낮습니다.

3. 산소 요구량이 낮고 강한 환기와 교반을 견디지 못합니다.

4. 집단 성장 효과, 부착 성장 의존성)

5. 배양과정의 산물이 세포 내부와 외부에 분산되어 비용이 많이 든다

6. 1차 배양세포는 일반적으로 50세대 동안 번식한 후 퇴화된다. 죽어가는

체외 배양에 따르면 동물 세포는 성장 기질 의존성의 차이로 인해 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다.

고정 의존성 세포: 고체 또는 세포에 부착되어야 합니다. 비림프성 세포, 조직구 및 많은 이수성 세포를 포함한 대부분의 동물 세포가 성장하기에 적합한 양의 전하를 갖는 반고체 표면입니다.

고정 독립 세포: 혈액, 림프 조직 세포, 많은 종양 세포 및 일부 변형된 세포를 포함하여 성장하기 위해 고체 표면에 부착할 필요가 없는 세포입니다.

세포 배양의 최적 온도는 다양한 세포나 조직을 채취하는 신체의 정상 온도와 동일하다. 인간과 포유류의 세포 배양에 가장 적합한 온도는 35~37°C입니다. 온도가 이 온도에서 벗어나면 세포의 정상적인 신진대사와 성장이 영향을 받거나 심지어 죽게 됩니다. 일반적으로 배양된 세포는 고온보다 저온에 더 잘 견딥니다. 온도가 39°C를 초과하지 않을 때 세포 대사의 강도는 온도에 비례합니다. 세포를 39~40°C의 환경에서 1시간 동안 배양하면 약간의 손상을 입지만 여전히 회복할 수 있습니다. 온도가 43°C 이상에 도달하면 많은 세포가 죽습니다. 온도가 30~20°C로 떨어지면 세포 대사가 감소하여 배양 배지와의 물질 교환이 감소합니다. 가장 먼저 보이는 것은 세포 형태의 변화와 매트릭스에서 세포의 분리입니다. 배양물이 원래의 배양 온도로 돌아오면 원래의 형태와 대사도 원래 수준으로 돌아갑니다.

2. 접착배양(attachmentculture)

특정 고체 표면에 부착된 세포를 배양하는 것을 말합니다.

1. 성장 특성: 접착 의존성 세포는 배양 중에 배양(병) 용기의 벽에 부착해야 합니다. 일단 세포가 벽에 부착되면 빠르게 퍼지다가 유사 분열을 시작하고 빠르게 진행됩니다. 로그 성장 기간을 입력합니다. 일반적으로 며칠 내에 배양 표면이 덮이고 조밀한 세포 단층이 형성됩니다.

2. 부착배양의 장점:

배양배지 교체가 용이하고, 세포가 고체표면에 밀착되어 있으며, 기존의 배양배지를 직접 쏟아낼 수 있으며, 세척 후 바로 새로운 배양 배지를 추가할 수 있습니다.

세포가 표면에 고정되어 있어 여과 시스템이 필요하지 않기 때문에 세포 밀도를 높이는 목적을 달성하기 위해 관류 배양을 사용하는 것이 쉽습니다.

세포가 성장 매트릭스에 부착되면 많은 세포가 생성물을 보다 효율적으로 발현하게 됩니다.

동일한 장비라도 서로 다른 배양배지/세포 비율을 사용할 수 있습니다.

모든 세포 유형에 적합합니다.

3. 부착배양의 단점: 부유배양법에 비해

배양 확산이 어렵고 투자비용이 크다.

넓은 면적,

세포 성장을 효과적으로 모니터링할 수 없음,

4. 세포가 부착되는 표면: 순 양전하와 높은 수준의 표면 활성이 필요합니다. 미세담체는 또한 특정 전하 밀도를 가져야 하며, 유기 표면인 경우 친수성이고 양전하를 띠어야 합니다.

5. 부착 배양 시스템: 주로 스피너 플라스크, 중공 섬유(후술), 유리 비드, 마이크로캐리어 시스템(후술) 등을 포함합니다.

롤러 플라스크 배양 시스템: 부착 의존성 세포를 초기에 스피너 플라스크 시스템을 사용하여 배양했습니다. 롤러 플라스크 배양은 일반적으로 소규모 배양에서 대규모 배양으로의 전환 단계에서 사용되거나 생물반응기에서 접종을 위한 세포를 준비하는 방법으로 사용됩니다. 세포는 회전하는 원통형 배양 용기(롤러병)에 접종됩니다. 배양 과정에서 롤러병은 세포가 배양 배지와 공기에 교대로 노출되도록 지속적으로 회전하므로 더 나은 물질 전달 및 열 전달 조건을 제공합니다.

롤러병 배양은 구조가 간단하고 투자가 적으며 기술이 성숙하고 반복성이 뛰어나며 증폭은 스피너 병의 수를 늘리기만 하면 된다는 장점이 있습니다. 그러나 높은 노동 강도, 넓은 바닥 공간, 단위 부피당 세포 성장을 위한 작은 표면적, 낮은 세포 성장 밀도, 배양 중 환경 조건을 모니터링하고 제어하는 ​​데 한계가 있다는 단점도 있습니다. 현재 사용되는 회전식 병 배양 시스템에는 이산화탄소 인큐베이터와 회전식 병 기계가 포함됩니다.

이 배양 방법은 배양액과 함께 휘젓거나 흐르지 않고 세포가 고정된 표면에 부착되어 성장하므로 배양액 교체가 더 용이하고 특별한 세포 분리 장비가 필요하지 않습니다. 배양배지는 관류배양을 이용하여 높은 세포밀도를 얻고 효과적으로 제품을 얻을 수 있으나, 규모 확장이 어렵고 세포의 성장을 직접적으로 모니터링할 수 없기 때문에 주로 소량, 고가치의 바이오의약품 제조에 사용됩니다. .

CelliGen, CelliGen PlusTM 및 Bioflo3000 반응기는 일반적으로 부착 배양 생물반응기에 사용됩니다. 바스켓 교반 시스템과 디스크형 캐리어는 세포 부착 배양에 사용할 수 있습니다. 이 캐리어는 높은 표면적 대 부피 비율(1200cm2/g)을 지닌 직경 6mm의 부직 폴리에스테르 섬유 디스크로, 높은 세포 밀도를 달성하는 데 도움이 됩니다. 바스켓 교반 시스템과 캐리어 배양은 현재 부착성 세포 배양에 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 하이브리도마 세포, Hela 세포, 293 세포, CHO 세포 및 기타 세포의 배양에 사용됩니다. 이런 방식으로 세포를 배양하는데, 파종 후 세포가 빠르게 부착됩니다.

3. 현탁배양(Suspension Culture)

세포가 반응기 내에서 자유롭게 부유되어 자라는 과정을 말한다. 주로 하이브리도마 세포 등 부착 독립 세포 배양에 사용되며 미생물 발효를 기반으로 개발되었습니다.

무혈청 현탁배양은 동물 유래의 단백질이나 호르몬을 사용하여 동물 혈청을 대체하는 세포 배양 방식으로, 정제 후 작업을 줄이고 제품 품질을 점차 향상시키고 있습니다. 동물 세포의 주요 방법. 규모 배양의 새로운 연구 방향.

4. 고정배양(immobilizationculture)

동물세포를 수불용성 담체와 결합시켜 배양하는 것입니다. 위에서 언급한 두 가지 유형의 세포 모두 적합합니다. 세포 성장 밀도가 높고 전단력에 대한 저항성이 강하며 오염 방지 기능이 뛰어나 제품 분리 및 정제에 유리합니다. 제조 방법에는 흡착법, 이온가 결합법, 이온/이온가 가교법, 임베딩법, 마이크로캡슐화법 등 여러 가지가 있습니다.

1. 흡착법 : 고체 흡착제를 사용하여 세포를 표면에 흡착시켜 세포를 고정시키는 방법을 접착이라고 합니다. 조작이 간편하고 조건이 온화한 동물세포 고정화에 사용되는 최초의 연구 방법입니다. 단점은 캐리어의 적재 용량이 낮고 셀이 떨어지기 쉽다는 것입니다. 이 방법의 대표적인 것이 미세담체배양과 중공사배양이며, 추후 소개할 것이다.

2. 공유 결합 방법: 공유 결합을 사용하여 동물 세포를 고체상 담체와 결합시키는 고정화 방법을 공유 결합에 의한 부착이라고 합니다. 이 방법은 세포 누출을 줄일 수 있지만 세포 활동에 영향을 미치는 화학 시약의 도입이 필요합니다. 또한 부착으로 인해 확산 한계가 작고 세포가 보호되지 않습니다.

3. 이온/이온 가교 방법: 이중 기능성 시약은 세포 현탁액을 처리하여 세포와 응집체 사이에 가교를 형성하여 가교 효과를 생성합니다. 공유결합으로. 가교 시약은 일부 세포 사멸을 일으키고 확산 제한을 일으킬 수도 있습니다.

4. 포획 방법: 다공성 담체 내부에 세포를 삽입하여 고정화된 세포를 형성하는 방법을 포획이라고 합니다. 장점은 간단한 단계, 온화한 조건, 큰 부하 용량, 적은 셀 누출 및 기계적 전단에 대한 저항성입니다. 단점은 확산 제한, 모든 세포가 최적의 매트릭스 농도에 있는 것은 아니며 거대분자 매트릭스가 폴리머 네트워크 내부로 침투할 수 없다는 것입니다.

일반적으로 고정 독립 세포의 고정화에 적합하며 일반적으로 사용되는 담체는 아가로스 겔, 칼슘 알지네이트 겔 및 피브린과 같은 다공성 겔입니다.

5. 미세 캡슐화: 친수성 반투과성 막 층이 세포를 구슬 모양의 미세 캡슐로 둘러싸는 데 사용됩니다. 액체배양과 유사한 미세배양 환경으로 세포를 손상으로부터 보호할 수 있어 세포가 잘 자라고 밀도가 높습니다. 마이크로캡슐의 직경은 200~400μm로 조절하는 것이 바람직하다. 준비에 주의를 기울여야 합니다:

순하고 빠르며 세포를 손상시키지 않으며 가능한 한 액체 및 생리학적 조건에서 작동합니다.

시약 및 멤브레인 재료 사용되는 물질은 세포에 독성이 없습니다.

막의 기공 크기를 조절할 수 있어야 하며 영양분과 대사산물이 자유롭게 통과할 수 있어야 합니다.

막은 교반을 견딜 수 있을 만큼 충분한 기계적 강도를 가져야 합니다. 문화 중.