어느 분이 지방 세포의 일차 배양을 해 본 적이 있습니까

DMEM-ADMEM-B 콜라겐 효소 수컷 Sprague-Dawley 쥐 < P > 시약, 테스트 키트

KRBH 완충액 KRBH 그리고 3% O2? 혼합 기체의 플라스틱 상자 내 마취 쥐 (수컷 Sprague-Dawley 쥐: 145~17 g, CD 계 (Charles River Breeding Laboratories).

2. 칼로 머리를 부러뜨리고 피를 빼다.

3. 쥐의 몸을 에탄올 7% 에 잠시 담근다.

4. 가급적 무균 상태에서 부고환 지방 패드를 제거한다.

(a) 해부로 복부 피부를 잘라서 복막을 노출시킨다.

(b) 다른 해부로 복막을 절개한 다음 Perry 핀셋으로 고환을 위로 당깁니다.

(c) 부고환 지방 패드를 잘라서 혈관을 보존하도록 주의해라.

5. 조직을 훈련 실험실로 이송한다. < P > 지방세포의 콜라겐효소 (2 ml KRBH 완충액에 2 mg/ml 콜라겐효소를 넣고 .22 μm 필터로 걸러짐) 소화와 세탁

6. 4 g 지방 패드 (8 개 부고환 지방 패드에 해당) 를 4 ml KRBH 완충액 ( 1 mmol/L NaHCO3, 3 mmol/L HEPES(Sigma), 2 nmol/L 아데노신 (Boche) 및 1% BSA (W/V, Intergen) 를 추가합니다 1 L KRBH 버퍼를 준비할 때 7 g NaCl, .55 g KH2PO4, .25 g MgSO4 를 사용하시겠습니까? 7H2O, .84 g NaHCO3, .11 g CaCl2, 7.15 g HEPES, 1 g BSA, 1 ml 2 μmol/L 아데노신, 정수 1 L 까지 추가. 그런 다음 1 ml 로 나누어 주세요. 사용하기 전에 37°C 로 가열하고 pH 를 7.4 로 조정합니다. ) (37°C) 의 3 ml 저밀도 폴리 프로필렌 병.

7. 지방 패드를 직경 약 2 mm 의 조직 블록으로 자릅니다.

8. 조직 블록을 병에 넣고 1 ml 콜라겐효소액을 넣는다. 세포 혼합물이 유지지 같은 걸쭉한 액체를 형성할 때까지 37°C 수욕 발열기에서 약 1 h 를 부화한다.

9. 콜라겐효소가 소화된 후 병에 4 ml KRBH 완충액 (37°C) 을 넣는다.

1. 병 안의 세포를 섞은 다음 구멍 지름이 25 μm 인 나일론 필터 (구멍 지름이 25 μm 인 지지대나 깔때기 안에 넣음) 를 사용하여 세포를 5 ml 원추형 원심관으로 가볍게 걸러냅니다.

11. 원심관에 3 ml KRBH 완충액 (37°C) 을 넣어 세포를 씻는다. 데스크탑 원심분리기로 단시간 원심 (2 g) 을 한 다음 빨대로 맑은 액체를 빨아들인다. 지방 세포가 수성 완충액 위에 떠 있는 것을 주의해라.

12. 4 ml KRBH 완충액을 넣어 세포를 씻고 원심분리기를 통해 청액을 제거한다. 이 단계를 한 번 반복합니다.

13. 4 ml DMEM-A (DMEM, pH 7.4, 25 mmol/L 포도당, 2 mmol/L 글루타민, 1 μg/ml/l (r)-n6-을 넣는다 1 ml 로 나누어 사용하기 전에 37 C (37 C) (37 C) 로 세포를 두 번 세탁합니다.

14. 약 4% cytocrit DMEM-A 로 떠 있는 세포를 매달았다. < P > 2, 지방세포의 원대 배양

15. 2 μl 대구경 흡두로 2 ml 4% cytocrit DMEM-A 현액을 6 mm 페트리 접시로 옮긴다.

16. 페트리 접시를 촉촉한 배양함에 넣고 37°C 와 5% CO2 에 넣으시겠습니까? 조건 하에서 1.5 시간 동안 배양되었다.

17. 페트리 접시에 5 ml DMEM-B(DMEM-A, 7% BSA 추가) 를 넣는다. 이때 포도당 섭취 실험 [Quom 1998] 을 실시해 세포의 활력을 점검해야 한다.

-------------< p- 연 2, 양동지 1, 건전 1

(중산의과대학? 1. 손일선 기념병원 산부인과, 2. 생물연구실, 광동 광저우? 5112)

발췌? 예:? 인간 전 지방 세포의 일차 배양 방법을 확립하여 인체 지방 조직 증식의 생물학적 특징을 더 깊이 연구하는 것을 목표로 한다. -응? 방법 성인의 복부 지방 조직을 선택하고, 원대 소화세포 배양법을 이용하여 프리즘 세포를 배양한다. 피부 조직을 동시에 취하여 섬유세포 배양을 대조군으로 한다. -응? 그 결과 배양된 프리즘 세포 성분은 균일하고 증식이 왕성하며 분화율이 높다. 형태학의 동적 변화를 관찰한 결과, 성장곡선과 유홍색 O 지방염색 추출법 측정으로 기능이 활발한 전 지방세포임을 입증해 체외 증식의 전 과정을 재현했다. -응? 결론적으로 성숙한 지방조직에는 분화가 가능하고 성숙하며 지방을 생성하는 전 지방세포가 존재한다. 지방세포는 인슐린 작용의 고전적인 과녁 세포 중 하나이기 때문에 이 실험은 비만 및 인슐린 저항성과 관련된 질병 (예: 다낭 난소 증후군 등) 을 더 연구하기 위한 토대를 마련했다.

키워드: 전 지방 세포; 세포 배양 지방조직

중도분류번호: Q254,R711.75? 문서 식별 코드: a? 문장 번호: 1-257x (21) 6-443-4

primarycultureofhumanpreadipocyte

wangzhu? Chen1,LIUJian? Zhong2,LIYan2,YANGDong? Zi1, 쿠앙 진? 1 분기

(1. departmentofobstetricsandgynecology, sunyat? Senmemorialhospital, 2. departmentofbiology,

sunyat? Senuniversityofmedicalsciences, Guangzhou 5112, China)

abstract:? Objective toestablishaprimaryhumanpreadipocyteculturemethodforbetterunderstandingthepropertiesofhyperplasiaofhumanadiposetissue Methods usingprimarycellculture, fibroblast? Likecellsfromadultabdominaladiposetissuewerecultured.fibroblastsfromadulthumandermiswerealsoculturedtoserveascontrol? Results thecellswerehighlyhomogeneous, proliferativeandhadahighdifferentiationrate.theirdynamicmorphologicalchanges; Extractingstainedintracytoplasmiclipidwithoilredo, allverifiedtheirpreadipocyteidentity.undercontrolledconditions, ts Conclusion inmaturehumanadiposetissue, therexistpreadipocytesthatcandifferentintomatureadipocytes.sinceadipocyteisonekie Therprobingintoobesityandinsulinresistantdiseasessuchaspolycysticovarysyndrome.

keywords: preadipocyte; Cellculture; Adiposetissue

지방세포는 인슐린 작용의 고전적인 과녁세포 중 하나로, < P > 비만 및 인슐린 저항 관련 질환 (예: 다낭 난소 증후군) 의 < P > 연구와 밀접한 관계를 맺고 있으며 최근 몇 년간 산부인과 내분비 분야의 중중 < P > 를 받고 있다. 전 지방세포는 증식과 지방세포분점 < P > 능력을 가진 특이화된 전체세포로, 그 존재와 작용이 < P > 인 일생에서 지속되며, 우리는 인지방조직에서 전 지방 < P > 세포를 배양하여 진일보한 연구의 기초를 다졌다.

수납일: 21-4-23

기금 프로젝트: 광동성 보건청 과학연구기금 지원 과제 (21189)

,; 1? 재료 및 방법 1.1? 조직원은 2 년 9 월 ~21 년 1 월 본원 산부인과 내분비병실에서 나팔관 복통술을 하는 정상 체중 환자를 선정했다. 나이 2~4 세, 건강, 다른 급성 만성 질환은 없습니다. 수술 중 개복시 피하 지방 조직과 피부 조직을 잘라냅니다.

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1.2? 실험 재료

1.2.1? 주요 실험용품과 화학 시약? DMEM/F? 12 배양기 (1! 1), 마이코 플라스마 태아 소 혈청 없음,? 콜라게나 제, Hepes, 인간 트랜스페린, 청과 스트렙토 마이신 원액은 모두 GIBCO 에서 구입했습니다. 바이오틴, 범산염, 수소화코티손, 삼요오드 갑상샘아민산 (T3),3? 이소 부틸? 1? 메틸 황푸린 균계 시그마 회사 제품. 소 혈청 알부민은 Roche 에서 구입했습니다. 실험에 필요한 무기 시약 () 는 광저우시 의약회사화 시험 도매부 () 에서 구입하여, 모두 순수 시약 () 를 분석하였다. 배양병은 코린닝사에서 구매한다.

1.2.2? 배지 및 주요 시약 준비? 배양기 A[1] 중산의과대학보 (AcadJSUMS),21,22(6) 배양기 A 로 세포현액을 만들어 25cm2 배양병에 접종하는데 밀도는 제곱센티미터당 3? 1 개의 세포, 37#, 부피점수 5%CO2 배양함 안에서 16h 를 부화한 후, PBS 는 배양병 안에 붙어 있지 않은 물질을 부드럽게 씻어내고 배양기 C 로 바꿔 지방세포 분화를 유도하고 유지했으며, 3d 를 배양기 B 로 교체한 후 2~3d 마다 배양기 B 를 교체했다. 1.3.2? 인간 전 지방세포와 피부 섬유세포의 조직학 염색? 커버 슬라이드 으로 잘라? 5cm 요? 1? cm 사이즈로 접종할 때 배양병에 넣고 세포가 벽에 붙을 때까지 2, 3d 마다 배양병에서 염색을 꺼낸다. 지방세포가 붙어 있는 면을 위로 올리고, 부피분 < P > 이 1% 인 포름알데히드 등 침투염 완충액에 1min 을 고정한 다음 PBS 완충액에 넣고 가볍게 헹구고 직립하여 잔류 물을 가장자리로 흐르게 하고 흡수지를 빨아들인다. 약간 건조한 후, 인간 전 지방 세포는 수단% 를 사용합니까? & 점염법 및 메이어 소목소 복염세포핵, 글리세린 젤라틴 봉인; 피부성섬유세포는 기존의 소목소-이홍염색으로 탈수투명 후 중성수지 봉인, 광경 관찰 및 사진 보존 결과를 사용합니다.

1.3.3? 세포 성장 곡선 그리기? 세포 현액을 24 개의 배양병에 똑같이 접종하여 무작위로 8 개 그룹으로 나누고, 그룹당 3 병, 2d 검사 그룹당 병당 총 세포 수를 측정하고, 3 병의 평균을 취하여 그룹 8 이 끝날 때까지 합니다. 세포 계산 방법은 의학 세포 생물학 실험 [3] 을 참조한다.

1.3.4? 유홍 o 염색 추출법 세포 내 지방 함량 측정? 접종 방법은 1.3.3 과 동일합니다. Ramirez[2]4: 지시에 따라 DMEM/F 를 받습니까? 12 배양분 5g, 태우혈청을 첨가하여 부피점수를 1%, 삼증기를 5mL 까지 정용한다. 배지 b: 지침에 따라 DMEM/F 를 가져 가라. 12 배양가루 1g, 최종 농도를 각각 15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep? Es,33? 몰/L 범산염, 17? 몰/L 인 트랜스페린, 1U/L 페니실린, ? 1g/L 스트렙토 마이신, 1nmol/L 하이드로 코르티손, 6nmol/L 인슐린, ? 2nmol/LT3, 3 증기선 고정 용량 1mL; 배지 c: 배지 A2mL 을 가져 와서 3 을 추가 했습니까? 이소 부틸? 1? 메틸 크 산틴, 최종 농도를 으로 설정합니까? 25mmol/L; 소화액: 콜라게나 제 (? 유형) 15mg, 소 혈청 알부민 2g,? 1mol/L 인산 완충염 용액 (PBS) 은 1mL 로 정해져 있습니다. 적혈구 용해 완충액: 적당량의 NH4Cl,K2HPO4, EDTA 를 각각 154MMMOL/L, 5? 7mmol/L 및 ? 1mmol/L, 삼증기수

정용에서 25mL 까지. 위의 용액은 모두 pH 값을 7 로 조정했습니까? 4~7? 6,? 22? M 미세 다공성 막 양압 여과 살균, 분리 후 -3# 보존. 오일 레드 o 작동 유체 [2] 및 기타 방법 결정. 배양물용 부피점수 1% 포름알데히드의 등침투