플라스미드 미니프렙의 원리와 추출 과정 중 주의사항

플라스미드 미니프렙의 원리와 추출 과정 중 주의사항은 다음과 같습니다.

플라스미드 추출 시에는 신선한 세균액을 사용해야 하며, 세균을 여러 번 추출할 수 있습니다. 대수 단계에서 플라스미드 추출 속도가 가장 높습니다. 과잉 배양된 박테리아에는 죽은 박테리아와 불순물이 있을 수 있습니다. 박테리아가 노화되고 DNA도 적절해야 합니다. 그렇지 않으면 쉽게 불충분하게 용해됩니다. 수율과 순도에 심각한 영향을 미칩니다.

플라스미드 추출 중에 P1은 박테리아 세포를 현탁하고 저온에서 보관해야 합니다. 그렇지 않으면 플라스미드 추출 효율에도 영향을 미칩니다. P2에는 강한 알칼리를 사용하여 DNA를 절단하는 SDS와 수산화나트륨이 포함되어 있습니다. 플라스미드를 방출하므로 시간이 너무 길지 않아야 하며 천천히 뒤집어 혼합해야 하며 5분을 초과하지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 DNA가 짧은 조각으로 단편화되어 플라스미드에 혼합될 수 있습니다.

P3를 추가하고 여러 샘플을 작동하는 경우 각 추가 후 하나의 튜브를 혼합하는 것이 가장 좋습니다. P3는 추가 후 pH를 복원할 수 있으며 생성된 응집 침전물은 주로 단백질과 절단된 플라스미드를 복원할 수 있습니다. , 그러나 DNA는 그럴 수 없습니다. 원심분리 후에도 단백질 현탁액이 남아 있는 경우 다시 원심분리하거나 원심분리 시간을 연장할 수 있습니다.

WB의 가장 좋은 pH는 7.5입니다. 용출 중에 피펫을 비스듬히 추가하는 것이 가장 좋습니다. 이렇게 하면 튜브 벽의 염을 제거할 수 있고 수직으로 추가하여 코팅에 영향을 미치는 것을 피할 수 있습니다. 추출 효율을 저하시키지 않고 용출 시간을 연장하여 용출 효과를 높일 수 있습니다.

플라스미드 추출 지침

P1의 포도당은 점도를 높이고 기계적 전단력을 감소시키며 DNA 파손을 방지하고 박테리아 현탁을 보장합니다. EDTA는 특히 칼슘과 결합하는 킬레이트제입니다. 마그네슘 이온은 DNase에 의한 DNA 분해를 감소시킵니다.

P2의 NaOH와 SDS는 세포를 용해시키고 DNA와 단백질을 변성시키며 가교된 네트워크 구조를 형성하여 침전 및 제거가 가능합니다. 알칼리도가 너무 강해서 너무 오래 방치할 수 없습니다. 세게 흔들면 깨진 게놈 DNA 조각이 플라스미드와 섞일 수 있습니다.