밀크엉겅퀴 추출물의 분석방법

1. 분광광도법으로 실리마린 함량을 측정

본 제품의 분말을 적당량 달아 50ml 메스플라스크에 넣고 무수 에탄올 40ml를 넣어 녹입니다. , 적당량으로 희석하고 잘 흔들어 5ml를 100ml 메스플라스크에 정확하게 피펫팅하고 표시선까지 무수 에탄올을 넣고 잘 흔들어 섞은 후 동시에 공시험 대조액으로 한다. UV 분광 광도계는 288 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 다음 공식에 따라 함량을 계산합니다.

실리마린 함량 % = (실리빈으로 계산) × 100%

A: 샘플 흡광도 값 M: 샘플링 용량(g) V; : 시료 희석 계수 470: 실리비닌 흡수 계수.

참고: 이 방법은 랴오닝성의 현지 표준에서 파생되었으며 HPLC 값이 60% 이상인 밀크씨슬 추출물의 함량 측정에 적합합니다.

2. 분광광도법으로 실리마린 함량을 측정

정제된 추출물 약 250mg을 정밀하게 달아 50ml 메스플라스크에 넣고 적당량의 메탄올을 넣어 녹인다. 50ml로 조절하여 잘 흔들어 준 액이 검액이 됩니다.

10ml 메스플라스크에 검액 1ml를 넣고 2,4-디니트로페닐히드라진 시약 2ml를 넣어 잘 흔들어 섞은 후 마개를 막고 50°C에서 50분간 가열한 후 식힌 다음, 그리고 수소를 첨가한다. 산화칼륨 메탄올 용액을 표시선까지 가져와 잘 흔들어 섞은 후 2분간 방치한다. 이 액 1ml를 원심분리관에 취하고 메탄올 20ml를 넣어 잘 흔들어 섞은 후 원심분리한다. 적갈색 상등액을 50ml 메스플라스크에 붓고 잔류물에 메탄올 20ml를 가하여 원심분리한 후 상층액을 합하고 표시선까지 메탄올로 희석한다.

메탄올 1ml를 10ml 메스플라스크에 정확하게 피펫팅하고, 블랭크 컨트롤로 "2,4-디니트로페닐히드라진 시약 2ml 첨가"와 동일한 방법으로 조작합니다.

공시험액을 대조군으로 하여 490nm에서 측정된 농도의 흡광도 A값을 측정하여 E=537로 실리마린 함량을 계산한다.

3. 분광광도법에 의한 실리마린 함량 측정(독일 약전 DAB-9 판 1997)

표준 용액 준비: 실리빈 표준품 25mg을 정밀하게 달아 5ml 용량의 용기에 넣습니다. 플라스크에 메탄올을 넣어 녹이고 표시선까지 용량을 조절하여 5 mg/ml 농도의 표준용액을 만든다.

시료용액 조제 : 실리마린 250mg을 50ml 메스플라스크에 넣고 메탄올로 녹여 표시선까지 희석하여 따로 보관한다.

색소조제 : 2,4-디니트로페닐히드라진 시험용액 : 이 시약 500mg을 50ml 메스플라스크에 달아 H2SO4 1ml를 가하고 메탄올로 희석하여 100mm까지의 눈금을 얻는다.

10% KOH 용액: KOH 10g의 무게를 측정하고 100ml 용량 플라스크에 넣습니다. 물 30ml를 첨가하고 메탄올로 부피를 희석합니다.

측정방법 : 10ml 메스플라스크에 표준액, 검액 및 메탄올 각 1ml를 취하고, 2,4디니트로페닐히드라진 시험용액 2ml를 각각 3개의 메스플라스크에 넣는다. 수욕 50~55°C에서 50분간 반응시킨다. 수돗물로 급랭시킨 후 KOH용액을 표시선까지 가한다. 위의 3가지 반응용액 1ml를 마개가 달린 10ml 시험관에 넣는다. 메탄올을 넣고 10분간 원심분리한다. 맑은 액체를 각각 50ml 메스플라스크에 붓고 침전물을 원심분리한 후 메탄올 10ml를 넣고 잘 섞은 후 원심분리하고 상청액을 각각 같은 50ml 메스플라스크에 붓고 1회 반복한다. 50ml 용량 플라스크 3개 모두의 표시선까지 메탄올을 첨가합니다. 잘 흔들어서 UV 분광광도계로 490nm에서 흡광도 값을 측정합니다.

위 공식의 계산은 위의 요구 사항을 엄격하게 준수하는 샘플링 작업과 계량을 기반으로 합니다. 계량이 본문의 요구 사항을 정확하게 충족할 수 없는 경우 다음 공식에 따라 계산합니다.

A1: 샘플 흡광도 값, A2: 표준 흡광도 값, W1: 샘플 샘플링 용량(g), 샘플링 용량(g); V1: 샘플 희석 용량; V2: 표준 희석 용량

4. 분광 광도법에 의한 실리마린 함량 측정(미국 약전)

시험 용액: 약 1.0g을 추가합니다. 2,4-디니트로페닐히드라진(2,4-dinitrophenylhydrazine)을 8시간 진공건조한 후 정밀하게 달아 황산 2ml를 넣어 녹여 임시용액으로 한다.

표준용액 조제: USP 실리비닌 표준품을 정확하게 달아 메탄올에 녹여 약 2.0 mg/ml 농도의 용액을 만든다.

시료액 준비 : 밀크씨슬 미세분말 약 5.0g을 정밀하게 달아 추출슬리브에 넣고 작은 면봉으로 꽂는다. 연속 추출 장치에 연결된 헥산 150ml와 헥산 250ml가 들어 있는 둥근 바닥 플라스크에 추출 슬리브를 연결하고 슬리브를 4시간 동안 가열한 후 추출 장치에서 헥산이 들어 있는 둥근 바닥 플라스크를 분리합니다. 용매를 제거하고 건조시킵니다. 그런 다음 연속 열 추출 장치에 연결된 100ml의 에틸 아세테이트가 들어 있는 250ml 둥근 바닥 플라스크에 추출 슬리브를 연결합니다. 슬리브를 환류까지 8시간 동안 가열하고 40°C 회전 증발기에서 용매를 증발시켜 건조시킵니다. . 잔류물을 메탄올 25ml로 녹이고 정량적으로 여과하여 50ml 플라스크에 넣고 메탄올로 적당량만큼 희석하고 잘 흔들어준다. (참고: 이 준비 방법은 의약 물질에 적합합니다.)

검출: 두 개의 황색 10ml 플라스크에 표준 준비 용액과 검체 준비 용액 1.0ml를 넣고 정확하게 라벨을 붙인 후 시험 용액을 각각 2ml씩 넣습니다. , 믹스. 병에 코르크를 막고 50 ± 1°C로 유지한 후 50분간 천천히 저어줍니다. 냉각하고 용액을 메탄올로 희석하여 혼합합니다. 위의 액 2.0ml를 취하여 100ml 플라스크에 옮기고 테트라히드로암모늄히드록실메탄올용액(25%) 3.0ml를 첨가한다. [참고: 투명한 무색의 테트라히드로암모늄히드록실용액을 임시조제한다] 메탄올로 적당량을 희석하고 플라스크를 30분간 방치합니다. 동시에 1cm 흡광셀에서 표준액과 검액의 흡광도를 490nm에서 측정하며, 메탄올용액을 공시험료로 하고 다음 식에 따라 실리빈과 실리마린의 함량을 백분율로 구한다. :

5000(C /W) (Au/As)

C: 표준용액 중 실리빈의 농도(mg/ml) W: 건조된 실리마린의 중량 샘플 준비 용액에 사용된 Au 및 As는 각각 샘플 준비 용액과 표준 준비 용액의 흡광도입니다.

5. HPLC(INA 방법)에 의한 실리마린 함량 측정

크로마토그래피 조건: 컬럼: YMC-Mark ODS C18 5u 4.6×150mm(또는 Phenomenex Luna C18 5u 4.6×150mm) 이동상: 액체 A: 995ml 메탄올-물 용액(20:80)에 5ml 인산 첨가, 액체 B: 995ml 메탄올-물 용액(80:20)에 5ml 인산 첨가, 표 7의 절차에 따라 용출 -1; 유속: 1.0ml/분; 컬럼 온도: 40C; 검출 파장: 288nm;

표준액 조제 : 진공건조한 실리비닌 10.00mg을 정밀히 달아 메탄올에 녹인 후 대조액 25ml로 조정한다. 1:2, 1:10, 1:25, 1:50의 비율로 희석하세요.

시험액 조제 : 약용분말 약 10g을 정밀하게 달아 헥산 100ml를 속슬렛추출기에 넣고 수욕상에서 색이 연한(또는 무색) 때까지 4시간 동안 추출한 후 액을 추출한다. 버리고 용매를 증발시켜 잔류물을 건조시킨 후 잔류물에 메탄올 90ml를 가하여 수욕상에서 8시간 동안 환류 추출한 후 식힌 후 추출물을 100ml로 정량하여 25배 희석하여 여과하고, 여과액은 시험 용액이다.

추출물 : 엑기스분말 70mg(정확도 0.1mg)을 정밀히 달아 메탄올 70ml를 넣고 20분간 초음파 추출한 후 식힌 후 100ml로 희석하여 여과한다.

측정방법 : 그림 7-2와 같이 대조용액, 추출용매, 시험용액을 각각 주입한다. 표준품의 피크면적과 농도를 이용하여 실리비닌 A와 B의 선형 상관계수는 0.999 이상이고 분해능은 1.8 이상이어야 한다. 각 성분의 상대적인 머무름 시간은 표 7-2에 나와 있습니다.

표 7-2 각 성분의 상대 머무름 시간

성분 YMC-Park Luna

계산: 위의 각 성분의 전체 피크 면적에 따름 실리빈 측정.

6. HPLC를 통한 밀크씨슬 추출물의 SilibininA 및 B 함량 측정

크로마토그래피 조건: 사전 컬럼: 2cm Bondapak C18/37-50Micron 컬럼: 25cm RP18, 5μm; 이동상 및 용출 절차는 표 7-3에 나와 있습니다. 유속: 1.0ml/분, 검출 파장: 288nm, 주입량: 10μl.

표 7-3 이동상 용출 과정

시간(분) 5% 아세트산 메탄올 용액 5% 아세트산

그림 7-2 밀크엉겅퀴 추출 HPLC 차트

시험액 : 추출물 0.05g(30%)을 메탄올 100.0ml에 녹인 후 0.45μm 필터로 여과하여 용액을 얻는다.

대조 용액: 메탄올을 사용하여 약 0.15mg/L의 실리비닌을 함유하는 용액을 제조합니다.

SilibininA+B 피크 면적 외부 표준(%) 방법으로 계산했습니다.

7. 밀크엉겅퀴 추출물 중 헥산과 에탄올의 잔류량을 측정하기 위한 가스크로마토그래피(헤드스페이스 샘플링)

내부표준용액: 펜탄 250mg을 정확하게 달아 만든다. 최대 10ml 용량 플라스크.

보정 용액: 에탄올, 헥산, 펜탄 100mg을 정확하게 계량하고 자일렌을 첨가하여 10ml 메스플라스크로 만듭니다. 용액 10μl를 헤드스페이스 샘플링 병에 피펫으로 넣고 밀봉합니다.

시험용액 : 건조추출물 0.1~0.5g을 정밀히 달아 헤드스페이스 샘플링병에 넣고 내부표준용액(펜탄 250mg에 해당) 10μl를 넣고 밀봉한다.

헤드스페이스 샘플링 매개변수: 온도: 110℃; 온도 조정 시간: 10분; 압력 조정 시간: 1분.

크로마토그래피 조건: 컬럼: DB-1 실리카겔 모세관, 내경 30m×0.25mm, 두께 0.1μm. 오븐 온도: 7분 동안 40°C, 이후 12°C/분, 180°C까지 유지, 30°C/분 동안 280°C까지 유지, 이후 10분 동안 유지. 주입기: 150℃, 검출기: FID250℃, 운반 가스: 질소(5psi), 통합 정지 시간: 25분

정량화를 위해 내부 표준 크로마토그래피 피크의 통합 값을 사용하고 다음 공식에 따라 계산합니다.

F=Ac×Ms/(Mc×As)

Ac: 제품의 참조 표준물질 크로마토그래피 피크 면적; Ms: 내부 표준물질의 양(μg/μl) As: 내부 표준물질의 크로마토그래피 피크 면적(μg/μl) .

함량(mg/kg) =Ac×Ms×100/(F×As×E)

Ac: 시험 용액 내 용매의 크로마토그래피 피크 면적; : 시험 용액 내 내부 표준물질의 양 As: 시험 용액 내 내부 표준물질의 크로마토그래피 피크 면적 E: 샘플링 부피.

참고: 검출 한계: 둘 다 1ppm입니다. 체류 시간: 에탄올의 경우 약 5.5분, 헥산의 경우 약 10분입니다.

한도: 에탄올은 0.5%를 초과해서는 안 되며, 헥산은 10ppm을 초과해서는 안 됩니다.

8. 가스크로마토그래피를 이용한 밀크엉겅퀴 추출물의 아세톤 잔류량 측정

내부표준용액: 아세톤의 무게를 정확하게 측정하고 물을 첨가하여 6.00mg/ml로 조정합니다.

보정 용액: 아세톤의 무게를 정확하게 측정하고 물을 첨가하여 0.30mg/ml로 조정합니다.

시험용액 : 건조추출물 5g을 정밀히 달아 물 120ml를 가하고 가열한 후 소포제 2방울 및 내부표준용액 5.00ml를 가한다. 약 80ml로 증발시킵니다.

크로마토그래피 조건: 컬럼: OV101, 내부 직경 0.32mm, 두께 0.1μm; 오븐 온도: 30℃에서 주입기: 250℃, 운반 가스: 헬륨 가스; 유속: 1ml/분; 분할 비율: 1:70.

외부 표준 크로마토그래피의 피크 적분값을 이용하여 정량화합니다.

참고: 검출 한계: 아세톤 0.1ppm, 정량 한계: 아세톤 1.0ppm, 체류 시간: 아세톤 약 4.7분.

한도: 아세톤은 20ppm을 초과해서는 안 됩니다